PENGERTIAN TENTANG KULTUR JARINGAN
Menurut Suryowinoto (1991), kultur jaringan dalam
baha asing disebut sebagai tissue culture. Kultur
adalah budidaya dan jaringan adalah
sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. jadi, kultur
jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil
yang mempunyai sifat seperti induknya.
Kultur jaringan akan lebih besar presentase
keberhasilannya bila menggunakan jaringan meristem. Jaringan meristem adalah jaringan muda, yaitu
jaringan yang terdiri dari sel-sel yang selalu membelah, dinding tipis,
plasmanya penuh dan vakuolanya kecil-kecil. Kebanyakan orang menggunakan
jaringan ini untuk tissue culture. Sebab, jaringan meristem keadaannya selalu
membelah, sehingga diperkirakan mempunyai zat hormon yang mengatur pembelahan.
Teknik kultur jaringan sebenarnya sangat
sederhana, yaitu suatu sel atau irisan jaringan tanaman yang sering disebut eksplan secara aseptik diletakkan dan
dipelihara dalam medium pada atau cair yang cocok dan dalam keadaan steril.
dengan cara demikian sebaian sel pada permukaan irisan tersebut akan mengalami
proliferasi dan membentuk kalus. Apabila kalus
yang terbentuk dipindahkan kedlam medium diferensiasi yang cocok, maka akan
terbentuk tanaman kecil yang lengkap dan disebut planlet. Dengan teknik kultur jaringan ini hanya dari satu irisan
kecil suatu jaringan tanaman dapat dihasilkan kalus yang dapat menjadi planlet dalam jumlah yang besar.
Pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman ini
berdasarkan teori sel sperti yang dikemukakan oleh Schleiden, yaitu bahwa sel
mempunyai kemampuan autonom, bahkan
mempunyai kemampuan totipotensi.
Totipotensi adalah kemampuan setiap sel, darimana saja sel tersebut diambil,
apabila diletakkan dilingkungan yangsesuai akan tumbuh menjadi tanaman yang
sempurna.
Teknik kultur jaringan akan berhasil dengan baik
apabila syarat-syarat yang diperlukan terpenuhi. Syarat-syarat tersebut
meliputi pemilihan eksplan sebagai
bahan dasar untuk pembentukkan kalus, penggunaan medium yang cocok, keadaan
yang aseptik dan pengaturan udara yang baik terutama untuk kultur cair.
Meskipun pada prinsipnya semua jenis sel dapat ditumbuhkan, tetapi sebaiknya
dipilih bagian tanaman yang masih muda dan mudah tumbuh yaitu bagian meristem,
seperti: daun muda, ujung akar, ujung batang, keping biji dan sebagainya. Bila
menggunakan embrio bagian bji-biji yang lain sebagai eksplan, yang perlu
diperhatikan adalah kemasakan embrio, waktu imbibisi, temperatur dan dormansi.
MANFAAT KULTUR JARINGAN
Kegunaan utama dari kultur jaringan adalah untuk
mendapatkan tanaman baru dalam jumlah banyak dalam waktu yang relatif singkat,
yang mempunyai sifat fisiologi dan morfologi sama persis dengan induknya. Dari
teknik kultur jaringan tanaman ini diharapkan juga memperoleh tanaman baru yang
bersifat unggul. Secara lebih rinci dan jelas berikut ini akan dibahas secara
khusus kegunaan dari kultur jaringan terhadap berbagai ilmu pengetahuan.
Perbanyakan tanaman secara besar-besaran telah
dibuktikan keberhasilannya pada perkebunan kelapa sawit dan tebu. Dengan car
kultur jaringan dapat klon suatu
komoditas tanaman dalam relatif cepat. Manfaat yang dapat diperoleh dari
kloning ini cukup banyak, misalnya: di luar pulau Jawa akan didirikan suatu
perkebunan yang membutuhkan bibit tanaman dalam jumlah ribuan, maka sudah dapat
dibayangkan betapa mahalnya biayanya hanya untuk trasnportasi saja. Hala ini
dapat diatasi denga usaha kloning melalui budaya jaringan, karena hanya perlu
membawa beberapa puluh botol planlet
yang berisi ribuan bibit. Dengan cara ini dapat menghemat waktu dan biaya yang
cukup banyak dalam persiapan pemberangkatan ataupun transportasinya. Pada
ekspor anggrek, misalnya, orang luar negeri menghendaki bunga anggrek yang
seragam baik bentuk maupun warnanya. Dalam hal ini dapat dipenuhi juga dengan
usaha kloning. Bibit-bibit tanaman dari usaha mericlono (tanaman hasil budidaya meristem) akan berharga lebih
mahal, karena induknya dipilih dari tanaman yang mempunyai sifat paling bagus
(unggul).
Kultur jaringan tanaman telah dikenal banyak orang
sebagai usaha mendapatkan varietas baru (unggul) dari suatu jenis tanaman dalam
waktu yang relatif lebih singkat dari pada dengan cara pemuliaan tanaman yang
harus dilakukan penanaman secara berulang-ulang sampai beberapa generasi. Untuk
mendapatkan varietas baru melalui kultur jaringan dapat dilakukan dengan cara
isolasi protoplas dari 2 macam varietas yang difusikan. Atau dengan cara
isolasi khloroplas suatu jenis tanaman yang dimasukkan kedalam protoplas jenis
tanaman yang lain, sehingga terjadi penggabungan sifat-sifat yang baik dari
kedua jenis tanaman tersebut hingga terjadi hibrid somatik. Cara yang lain
adalah dengan menyuntikkan protoplas dari suatu tanaman ketanaman lain.
Contohnya transfer khloroplas dari tanaman tembakau berwarna hijau ke dalam
protoplas tanaman tembakau yang albino, hasilnya sangat memuaskan karena
tanaman tembakau menjadi hijau pula. Contoh lain adalah keberhasilan
mentrasnfer khloroplas dari tanaman jagung ke dalam protoplas tanaman tebu
hasilnya memuaskan (Anik Herawati, 1991).
Khloroplas yang ditransfer harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut:
Ø Sewaktu dilakukan isolasi, khloroplas harus
sempurna.
Ø Setelah diisolasi harus mempuyai sifat yang sama
dengan khloroplas yang tumbuh secara in vivo (budidaya biasa).
Ø Setelah diisolasi masih mempunyai sifat atau
aktivitas fotosintesa yang cukup tinggi.
Ø Contoh isolasi protoplas dalam budidaya jaringan
yang sangat berguna adalah ditemukannya sun-chlorella
(jenis ganggang). Ganggang ini secara enzimatis dijadikan protoplas (sel-selnya
ditelanjangi dengan cara diinkubasikan dalam enzim medium sehingga dinding
selnya larut), kemudian dikeringkan dibawah sinar matahari. Protoplas tersebut
selanjutnya dipecah hingga didapatkan khloroplas dan akhirnya dibuat pil-pil
untuk pengobatan.
Menciptakan varietas baru dapat pula dilakukan
dengan menggunakan bantuan jenis bakteri seperti bakteri penyebab tumor yang
disebut Agrobacterium tumifaciens.
Bakteri ini disuntikkan pada tanaman sehat mempunyai buah ukuran besar, agar
tanaman sehat tersebut menjadi sakit tumor. Bakteri yang berada dalam jaringan
yang menonjol karena terkena tumor tersebut kemudian diambil dan disuntikkan
kedalam tanaman lain yang ukuran buahnya kecil-kecil. Dengan cara ini terbukti
bahwa tidak lam kemudian tanaman tersebut menghasilkan buah yang ukurannya
besar. Hal ini membuktikan bahwa bakteri yang dipindahkan tersebut membawa
sifat keturunan yang ada pada tanaman semula. Sedangkan untuk mendapatkan yang
baru yang tahan terhadap stress
garam, pestisida tertentu, logam berat, suhu rendah atau tinggi dan sebagainya
dapat dilakukan dengan cara-cara khusus.
Menciptakan tanaman baru yang toleran terhadap stress garam pernah dilakukan oleh Handa
dkk. (Suryowinoto, 1985) yaitu terhadap tanaman tomat dan tembakau. Pada
penelitian ini menggunakan penambahan PEG (Poly Ethilen- Glycol) atau NaCL,
yang biasa dipergunakan untuk mendapatkan kultivar yang toleransi terhadap
garam.
Beberapa jenis tanaman ada yang teramcam punah (endangered species), misalnya berbagai
jenis tanaman pisang, tanaman melati, kenanga, kayu jati, dan kayu putih. Usaha
yang paling tepat untuk melestarikan tanaman yang terancam punah adalah dengan
jalan kloning. Dengan usaha kloning ini, populasi dari tanaman tersebut akan
terselamatkan, bahkan dapat bertambah, sekaligus sifat-sifat yang dimiliki oleh
tanaman tersebut tetap terjamin.
Kultur jaringan juga mempunyai manfaat yang besar
dibidang farmasi, karena dari usaha ini dapat dihasilkan metabolit skunder
upaya untuk pembuatan obat-obatan, yaitu dengan memisahkan unsur-unsur yang
terdapat di dalam kalus ataupun protokormus, misalnya alkoloid, steroid,
dan terponoid. Dengan ditemukannya cara mendapatkan metabolit skunderdari kalus
suatu eksplan yang di tumbuhkan dalam medium kultur jaringan, mak berarti dapat
menghemat waktu dan tenaga. Dengan cara biasa, untuk mendapatkannya harus
menunggu lama samapai tanaman cukup umur bahkan sampai berproduksi hingga
bertahun-tahun. Sedangkan dengan teknik kultur jaringan hanya membuthkan waktu
antara tiga minggu sampai satu bulan saja. Metabolit yang dihasilkan dari kalus
ternyata juga memiliki kadar yang lebih tinggi daripada dengan cara biasa
(langsung dari tanaman). Dengan cara pengambilan metabolit skunder dari kalus,
biasanya selalu diperoleh kandungan lain yang lebih banyak jenisnya, karena
seringkali timbul zat-zat alkaloid atau persenyawaan-persenyawaan lainnya yang
sangat berguna untuk pengobatan.
Persenyawaan yang bermanfaat yang diambil dari
kalus dapat ditingkatkan kadarnya dengan cara memanipulasinya, antara lain:
Ø Memakai medium lain yang sesuai.
Ø Mengubah salah satu kadar komponen dalam medium.
Ø Memberi zat tambahan tertentu ke dalam medium,
misalnya penambahan zat pengatur tumbuh auksin ataupun sitokinin.
Kultur jaringan juga memberikan masukkan atau
informasi pengetahuan yang sangat bermanfaat dibidang fisiologi tanaman. Pada
tanaman anggrek misalnya, telah berhasil diketahui bahwa jika ujung akarnya
diiris melintang akan memperlihatkan warna tertentu. Warna tersebut nantinya
akan sama dengan warna bunganya. Hal ini sangat berguna dalam bidang perdangan
bunga hias, sebab walaupun tanamannya belum berbunga orang sudah dapat
mengetahui warna bunga yang akan muncul.
Melalui perbanyakan vegetatif dengan kultur
jaringan ternyata juga berpengaruh terhadap devisa negara. Misalnya, denagn
terlaksananya ekspor tanaman anggrek ke negara lain, maka akan menaikkan
devisan negara dibidang pertanian.
Teknik kultur jaringan sampai saat ini memang
belum biasa dilaksanakan oleh para petani, baru beberapa kalangan pengusaha
swasta saja yang sudah mencoba melaksanakannya, karena pelaksanaan teknik
kultur jaringan tanaman memerlukan keterampilan khusus dan harus diltar
belakangi dengan ilmu pengetahuan dasar tentang fisiologi tumbuhan, anatomi
tumbuhan, biologi, kimia dan pertanian. Dengan demikian jelas akan amat sulit
untuk diterima oleh kalangan petani biasa. Di samping itu, pelaksanaan teknik
kultur jaringan mutlak memerlukan laboratorium khusus, walaupun dapat di
usahakan secara sederhana (dalam ruang yang terbatas), namun tetap memerlukan peralatan
yang memadai. Kemungkinan lain petani akan merasa enggan bekerja secara aseptik. Karena semua pekerjaan harus
dilaksanakan secara hatri-hati dan cermat serta memerlukan kesabaran yang
tinggi. Biaya untuk mewujudkan perbanyakan tanaman cecara in vitro ini juga sangat mahal, kecuali kita meramu medium sendiri.
Bila kia terpaksa harus membeli medium yang sudah jadi (dalam kemasan) jelas
akan sangat mahal, sebab medium yang sudah jadi masih harus di impor dari luar
negeri. Apalagi kita harus membeli saran untuk perlakuan isolasi dan fusi
protoplas, tentu biayanya akan bertambah besar. Enzim-enzim yang digunakan
dalam kultur jaringan juga masih dibeli dari luar negeri sepertti Jepang.
Lepas semua dari kendala-kendala tersebut diatas,
kita harus mengakui bahwa teknik kultur jaringan sangat bermanfaat bagi dunia
ilmu pengetahuan, terutama untuk pengembangan bioteknologi.
ALAT-ALAT LABORATORIUM KULTUR JARINGAN
A. Laminar Air Flow Cabinet (LAFC)
Alat ini letaknya diruang penabur, yaitu ruang
yang selalu harus dalam keadaan steril. alat ini digunakan sebagai tahap
perlakuan penanaman.
B. Enkas
Merupakan bentuk lama dari alat penabur (LAFC), maka fungsinya pun sama
seperti (LAFC)
C. Shaker (penggojok)
Merupakan alat penggojok yang putarannya dapat diatur menurut kemauan kita.
Penggojok ini dapat digunakan untuk keperluan menumbuhkan kalus pada eksplan
anggrek atau untuk membentuk protokormusatau sering disebut plb (protocorm like bodies) dari kalus
bermacam jaringan tanaman.
D. Autoklaf
Autoklaf adalah alat sterilisasi untuk alat dan medium kultur jarinang
tanaman.
E. Timbangan Analitik
Jenis alat ini bermacam-macam, tetapi yang penting
adalah timbanagn yaang dapat dipergunakan untuk menimbang sampai satuan yang
sangat keil. Alat ini berfungsi sebagai alat untuk menimbang bahan-bahan kimia
yang digunakan untuk kultur jaringan.
F. Stirer
Alat ini berfungsi untuk menggojok dengan pemanas. Dengan menggunakan
listrik, alat ini berfungsi sebagai kompor disamping sebagai penggojok.
G. Erlenmeyer
Alat ini digunakan dalama kultur jaringan tanaman sebagai sarana
mmenuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eeksplan.
H. Gelas Ukur
Gelas ukur digunakan untuk menakar air suling dan bahan kimia yang akan
digunakan.
I. Gelas Piala
Alat ini digunakan untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan kimia dan air
suling dalam pembuatan medium.
J. Petridish
Alat ini merupakan semacam jenis gelas piala yang
mutlak dibutuhkan dalam kultur jaringan.
K. Pinset dan Scalpel
Pinset digunakan untuk memegang atau mengambil irisan eksplan atau untuk
menanam eksplan
L. Lampu Spiritus
Digunakan untuk sterilisasi dissecting
kit (skalpel dan pinset) di dalam laminar air flow cabinet atau di dalam
enkas pada kita mengerjakan penanaman atau sub-culture.
M. Tabung Reaksi
Alat ini digunakan pada saat mengerjakan isolasi
protoplas dan isiolasi khloroplas.
FASILITAS LABORATORIUM KULTUR
JARINGAN
Fasilitas laboratorium kultur jaringan di bagi
dalam beberapa bagian yang fungsinya satu sama lainnya berbeda-beda dan
persyaratannya pun berbeda-beda pula. Laboratorium kultur jaringan harus
dirancang secara khusus. Karena ada bagian-bagian atau ruangan-ruanagn yang
harus dalam suasana steril atau bebas mikroba.
Ruang-ruang dalam kultur jaringan di kelompokkan
menurut macam kegiatan yang ada di dalamnya,, yaitu sebagai berikut:
A. Ruang Tidak Steril
1. Ruang Tamu.
Dalam laboratorium kultur jaringan sebaiknya di
lengkapi dengan ruang tamu, karena biasanya laboratorium kultur jaringan selalu
di datangi tamu baik tamu yang ingin melihat sarana dan suasana laboratorium
maupun tamu ingin membeli hasil biakan kultur jaringan.
2. Ruang Administrasi.
Segala surat-menyurat tentang pembelian
alat-alatlboratorium, pembelian media kultur jringan, penjualan bibit-bibit
hasil biakan kultur jaringan, dan transaksi-transaksi ataupun
perjanjian-perjanjian kerja sama tentang penelitian dilaksanakan di dalam
ruangan administrasi.
3. Ruang Staf.
Laboratorium kultur jaringan membutuhkan staf
peneliti dalam jumlah banyak, tujuannya adalah agar dapat di adakan pembagian
kerja sesuai dengan spesialisasinya
masing-masing. Di dalam ruang staf ini dapat pula di lakasanakan diskusi antar
staf pada waktu berkumpul bersama.
4. Kamar Mandi dan WC.
Ruang kultur jaringan harus dalam suasana bersih
untuk menghindari kontaminasi oleh
mikroba. Bila pekerja akan memasuki ruangan penabur atau ruang inkubator, tubuh
dan pakaiannya harus bersih, tidak berkeringat dan tidak berdebu. Untuk inilah
kamar mandi dan wc perlu diadakan.
5. Ruang Ganti Pakaian.
Untuk menghindari timbulnya kontaminasi oleh mikroba, maka para karyawan di dalam laboratorium
kultur jaringan perlu memakai pakaian yang bersih, dalam arti baru di cuci.
Oleh karena itu dalam ruangan kultur jaringan perlu di adakan ruang ganti
pakaian.
6. Ruang Tempat Penyimpanan Bahan
Kimia dan Alat-alat dari Gelas.
Komponen bahan kimia penyusun media kultur
jaringan sangat banyak macamna. Oleh karena itu, penyimpanannya memerlukan
pengaturn yang khusus supaya mudah mecarinya. Penyimpanan yang tidak teratur
akan mempelambat dalam pekerjaan, misalnya dalam mencari salah sau komponen
media saja membutuhkan waktu yang lama. Bahan kimia yang mahal harganya seperti
hormon tumbuh dan enzim untuk isolasi protoplas harus disimpan dala ruangan
yang sejuk.
Alat-alat dari gelas seperti erlenmeyer, gelas ukurdan alat gelas lainnya
perlu disimpan dalam almari tersendiri.
7. Ruang Preparasi.
Di dalam ruangan ini disediakan peralatan dan
tempat untuk mencuci alat-alat laboratorium yang akan digunakan. Peralatan yang
ada antara lain keranjang-keranjang plastik untuk tempat peralatan yang baru
dicuci.
8. Ruang Penimbangan dan
Sterilisasi.
Bermacam-macam media kultur jaringan dijual dalam
bentuk kemasan dengan harga yang relatif mahal. Oleh karena itu, staf
labolatorium lebih senang meramu sendiri medum tanam yang dibutuhkannya.dengan
demikian dibutuhkan lat untuk menimbang semua komponen bahan kimia tersebut.
Misalnya menimbang bahan kimia makro dan mikro.
9. Rumah Kaca (Green House)
Rumah kaca adalah suatu bangunan yang atap dan
sekeliling dinding bagian atasnya terbuat dari kaca. Tujuan penyediaan rumah
kaca adalah untuk tempat meletakkan pot-pot bibit tanaman, baik bibit yang akan
dijadikan bahan kultur jarinang maupun bibit hasil dari kultur jaringan yang
sudah siap djual atau dipelihara sendiri.
B. Ruang Tidak Mutlak Steril
1. Ruang Planlet.
Ruangan ini menggunakan alat pendingi (AC), maka
temperatur ruangan dapat mencapai sekitar 25OC sehingga ideal bagi pertumbuhan planlet.
Botol-botol yang berisi planlet jumlahnya dapat mencapai ratusan. Oleh sebab
itu, dalam ruangan ini perlu disediakan rak-rak alumuniaum yang dasrnya
berlobang-lobang untuk meletakkan botol-botol tersebut secara teratur dan rapi.
2. Ruang Inkubator.
Eksplan yang sudah ditanam dalam media kultur
jringan perlu dipantau pertumbuhannya setiap hari. Untuk pemantauan ini perlu
ruangan khusus yang keadaannya lebih steril
dari ruang planlet, yaitu ruang inkubator.
Ruang inkubator harus memiliki suhu kurang lebih 25OC dan harus dilengkapi dengan lampu-lampu neon,
karena eksplan yang ditumbuhkan dalam
ruangan inkubasi membutuhkan temperatru dan cahaya yang dapat diatur dan
disesuaikan dengan jenis eksplannya.
3. Ruang Shaker dsn Enkas.
Eksplan yang baru ditanam dan diinkubasikan dalam
ruang inkubator akan menghasilkan kalus.
Bila kalus ini cukup umur, maka dapat diperlukan suspensi sel, yaitu menumbuhkan suatu eksplan atau kalus dengan
menggunakan media cair (media yang tidak menggunakan zat pemadat atau agar),
kemudian digojok di atas shaker. Hasil
pertumbuhan kalus ini adalah berupa protokormus atau dalam istilah asing
disebut plb (protocorm like bodies). Bentuk protocormus
adalah bulat-bulat padat dan berwarna hijau. Bila keadaan protocormus sudah keadaan demikian maka
sudah siap dipindahkan kedalam media padat untuk di tumbuhkan menjadi planlet.
Enksa juga sering di letakkan dalam satu ruang dengan shaker, kegunaan
enkas ini sama dengan Laminar Air Flow Cabinet, yaitu untuk menabur eksplan.
C. Ruang Mutlak Steril.
1. Ruang Penabur.
Ruang penabur biasanya di buat dengan ukuran yang
tidak terlalu besar, yaitu 2x3 m2. tujuannya
adalah agar pelaksanaan sterilisasi ruangannya tidak membutuhkan waktu yang
lama dan tidak mengalami kesulitan. Dinding ruang penabur dilengkapi dengan
porselin, sehingga sterilisasi mudah dilakukan. Sterilisasi ruangan dilakukan
dengan cara menyemprotkan alkohol 96% dengan hand-sprayer. Sedangkan
sterilisasi lantai dengan menggunakan kain pel yang dibasahi alkohol 96%.
Sterilisasi ini mutlak harus dilakukan menjelang ruang penabur akan digunakan.
Bila saat calon penabur akan memasuki ruangan, lampu ultra violet harus
dimatkan terlebih dahulu kemudian menyalakan lampu neon biasa dan calon penabur
diperbolehkan memasuki ruangan tersebut. Sebaiknya, pada saat akan keluar lampu
neon di matikan dan setelah keluar menutup daun pintu kembali lampu ultra
violet dinyalakan. Dengan demikian steril ruangan dapat dijamin.
MEDIA TANAM KULTUR JARINGAN
A.
Unsur-unsur yang Dibutuhkan Tanaman
Sebelum menguraikan cara-cara membuat medium
kultur jaringan, maka terlebih dahulu kita harus mengetahui unsur-unsur yang
dibutuhkan untuk pertumbuhan tanaman. Unsur-unsur yang dibuthkan tanaman
dikelompokkan menjadi:
1. Garam-garam Anorganik
Setiap tanaman membutuhkan paling sedikit 16 unsur
untuk pertumbuhannya yang normal. Tiga unsur di antaranya adalah C,H,O yang di
ambil dari udara, sedangkan 13 unsur yang lain berupa pupuk yang dapat
diberikan melalui akar atau melalui daun. Pada perbanyakan tanaman secara
kultur jaringan. Semua unsur tersebut dibutuhkan oleh tanaman untuk
pertumbuhannya. Ada unsur yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah besar yang
disebut unsur makro, ada pula yang
dibutuhkan oleh tanaman dalam jumlah sedikit tetapi harus tersedia yang disebut
unsur mikro.
2. Zat-zat Organik
Zat-zat organik yang biasanya ditambahkan dalam
medium kultur jaringan adalah sukrosa, mio inositol, asam amino, dan zat pengatur tumbuh. Sedangkan sebagai
tambahan biasanya diberi zat organik lain seperti air kelapa, ekstrak ragi,
pisang, tomat, toge dan lain-lain.
B. Kegunaan Setiap Unsur Bagi
Tanaman
setelah kita mengetahui unsur-unsur yang
dibutuhkan oleh tanaman, maka sebelum kita menentukan unsur-unsur yang akan
digunakan untuk meramu medium kultur jaringan perlu mengetahui terlebih dahulu
kegunaan unsur-unsur tersebut bagi pertumbuhan tanaman atau jaringan tanaman.
1. Unsur Nitrogen (N)
Kegunaan unsur Nitrogen bagi tanaman adalah untuk
menyuburkan tanaman, sebab unsur N dapat membentuk protein, lemak dan berbagai
persenyawaan organik yang lain.
2. Unsur Fospor (P)
Dibutuhkan oleh tanaman untuk membentuk
karbohidrat. Maka, unsur P ini dibutuhkan secara besar-besaran pada waktu
pertumbuhan benih.
3. Unsur Kalium (K)
Memperkuat untuk tubuh tanaman, karena unsur ini
dapat digunakan untuk memperkuat serabut-serabut akar, sehingga daun, bunga dan
buah tidak mudah gugur.
4. Unsur Sulpur (S)
Unsur ini digunakan untuk proses pembentukan
anakan sehingga pertumbuhan dan ketahanan tanaman terjamin.
5. Unsur Kalsium (Ca)
Digunakan untuk merangsang pembentukkan bulu-bulu
akar, mengeraskan batang dan merangsang pembentukkan biji.
6. Unsur Magnesium (Mg)
Digunakan tanaman sebagai bahan mentah untuk
ppembentukkan sejumlah protein.
7. Unsur Besi (Fe)
Unsur ini digunakan sebagai penyangga (chelati
agint) yang sangat penting untuk menyagga kestabilan pH media selama digunakan
untuk menumbuhkan jaringan tanaman.
8. Unsur Sukrosa
Unsur ini sering ditambahkan pada medium kultur
jaringan sebagai sumber energi yang diperlukan untuk induksi kalus.
9. Unsur Glukosa atau Fruktosa
Unsur ini dapat digunakan sebagai unsur pengganti
sukrosa karena dapat merangsang beberapa jaringan.
10. Unsur Mio-inositol
Penambahan unsur ini pada medium bertujuan untuk
membantu diferensiasi dan pertumbuhan
sejumlah jaringan.
11. Unsur Vitamin
Vitamin-vitamin yang sering digunakan dalam
mediumklutur jaringan antara lain adalah Thiamin.
Thiamin adalah vitamin esensial yang
digunakan untuk medium kultur jaringan.
12. Unsur Asam Amino
Unsur ini diunakan oleh tanaman untuk proses
pertumbuhan dan diferensiasi sel.
Kebutuhan unsur asam amino oleh tanaman berbeda.
13. Unsur Zat Pengatur Tumbuh.
Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senywa
organik bukan hara, yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan
dapat merubah proses fisiologi tumbuhan. Zat pengatur tumbuh dalam tanaman
terdir dari lima kelompok yaitu, Auksin, Sitokinin, Giberelin, Etilen dan
Inhibitor dengan ciri khas dan pengaruh yang berlainan terhadap proses
fisiologis.
Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai
komponen medium bagi pertumbuhan dan diferensiasi.
Tanpa penambahan zat pengatur tumbuh dalam medium, pertumbuhan sangat terhambat
bahkan tidak akan tumbuh sama sekali.
C. Bentuk Fisik Media Tanam
Media tanam harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin
pertumbuhan eksplan. Bahan-bahan yang
diramu berisi campuran garam mineral sumber unsur makro dan unsur mikro, gula ,
vitamin, protein, dan hormon tumbuh. media tanam dalam kultur jaringan adalah
tempat untuk tumbuh eksplan. Media
tanam tersebut dapat berupa larutan (cair) atau padat. Media cair berarti
campuran-campuran zat kimia dengan air suling, sedangkan media padat adalah
media zat cair tesebut ditambah dengan zat pemadat agar.
D. Faktor Lingkungan
1.
Keasaman (pH)
Keasaman pH adalah nilai derazat keasaman atau
kebasaan dari larutan dalam air. Keasaman (pH) suatu larutan menyatakan kadar
dari ion H dalam larutan. Nilai di dalam pH berkisar antara 0 (sangat asam)
sampai 14 (sangat basa), sedangkan titk netral adalah pH pada 7.
Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik
kultur jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal
antara pH 5,0-6,0. Bila eksplan mulai
tumbuh, pH dalam lingkungan kultur jaringan tanaman umumnya akan naik apabila
nutrein habis terpakai.
Pengukuran pH dapat dilakukan dengan menggunakan
pH meter, atau bila menginginkan yang lebih praktis dan murah dapat digunakan
kertas pH. Bila ternyata pH medium masih kurang normal, maka dapat ditambah KOH
1-2 tetes. Sedangkan apabila pH melampaui batas normal dinetralkan dengan
penambahan HCL.
2.
Kelembapan
Kelembapan relatif (RH) lingkungan biasanya
mendekati 100%. RH sekeliling kultur mempengaruhi pola pengembangan. Jadi,
pengaturan RH pada keadaan tertentu memerlukan suatu bentuk diferensiasi Khusus.
3.
Cahaya
Intensitas cahaya yang rendah dapat mempertinggi embriogenesis dan organogenesis. Cahaya ultra violet dapat mendorong pertumbuhan dan
pembentukan tunas dari kalus tembakau pada intesitas yang rendah.
4.
Temperatur
Temperatur yang dibutuhkan untuk dapat terjadi
pertumbuhan yang optimum umumnya adalah berkisar di antara 200-300C. Sedangkan
temperatur yang optimum untuk pertumbuhan kalus endosperm adalah sekitas 250C.
E. Pembuatan Media Tanam
Sebelum membuat medium, maka terlebi dahulu kita
harus menentukan medium apa yang akan kita buat. Jenis medium dengan komposisi
unsur kimia yang berbeda dapat digunakan untuk media tumbuh dari jaringan
tanaman yang berbeda pula. Misalnya media Vacin
Went sangat baik untuk media tumbuh anggrek. Tetapi tidak cocok untuk media
tumbuh lain. Untuk eksplan dair
tanaman keras sring menggunakan medium WPM,
sedangkan untuk tanaman semusim (sayuran dan tanaman hias) sering menggunakan
medium MS. Medium Kundson C cocok
untuk menanam eksplan kelapa kopyor
dan anggrek.
Untuk membuat media kultur jaringan, biasanya
menimbang setiap komponen bahan kimia yang terdapat pada resep medium dasar.
Langkah ini kurang praktis karena memakan banyak waktu dan mengurangi
ketepatan. Selain itu, timbangan yang digunakan untuk menimbang sejumlah kecil
bahan kimia kadang-kadang tidak tersedia. Kendala ini dapat diatasi dengan
membuat larutan stoc terlebih dahulu, kecuali untuk unsur makronya. Jadi perlu
membuat larutan stoc mikro.
METODE PELAKSANAAN KULTUR JARINGAN
A. Metode Kultur Jaringan.
1. Dilihat dari Macam Media Tanam
Teknik kultur jaringan dapat dilaksanakan dengan dua metode yaitu:
a. Metode Padat (Solid Method)
Metode pada dilakukan dengan tujuan mendapatkan kalus dan kemudian dengan medium diferensiasi yang berguna untuk menumbuhkan akar dan tunas sehingga
kalus dapat tumbuh menjadi planlet. Media padat adalah media yang
mengandung semua komponen kimia yang dibutuhkan oleh tanaman dan kemudian
dipadatkan dengan menambahkan zat pemadat. Zat pemadat tersebut dapat berupa
agar-agar batangan, agar-agar bubuk, atau agar-agar kemasan kaleng yang yang
memang khusus digunakan untuk media padat untuk kultur jaringan.
Media yang terlalu padat akan mengakibatkan akar sukar tumbuh, sebab akar
sulit untuk menembus ke dalam media. Sedangkan media yang terlalu lembek akan
menyebabkan kegagalan dalam pekerjaan. Kegagalan dapat berupa tenggelamnya
eksplan yang ditanam. Eksplan yang
tenggelam tidak akan dapat tumbuh menjadi kalus,
karena tempat area kalus yaitu pada
irisan (jaringan yang luka) tertutup oleh medium. Metode padat dapat digunakan
untuk metode kloning, untuk
menumbuhkan protoplas stelah diisolasikan, untuk menumbuhkan planlet dari protokormus stelah dipindahkan dari suspensi sel, dan untuk menumbuhkan planlet dari prtoplas yang sudah difusikan (digabungkan).
b. Metode
Cair(Liquid Metho)
Penggunaan metode cair ini kurang praktis dibandingkan dengan metode padat,
karena untuk menumbuhkan kalus langsung dari ekspaln sangat sulit sehingga
keberhasilannya sangat kecil dan hana tanaman-tanaman tertentu yang dapat
berhasil. Oleh karena itu, penggunaan media cair lebih ditekankan untuk suspensi sel, yaitu untuk menumbuhkan plb (prtocorm like bodies). Dari
protokormus ini nantinya dapat tumbuh menjadi planlet apabila dipindahkan
kedalam media padat yang sesuai.
Pembuatan media cair jauh lebih cepat daripada media padat, karena kita
tidak p erlu memanaskannya untuk melarutkan agar-agar. Media cair juga tidak
memerlukan zat pemadat sehingga keadaannya tetap berupa larutan nutrein.
2. Dilihat dari Bahan atau Eksplan
yang Dipakai
Bila dilihat dari macam bahan yang digunakan, maka
metode kultur jaringan yang telah dikenal sekarang antara lain adalah:
1) Kultur meristem.
2) Kultur antera
3) Kultru endosperma
4) Kultur suspensi sel
5) Kultur protoplas
6) Kultur embrio
7) Kultur spora
8) Dan lain-lain
3. Dilihat dari Cara Pemeliharaan
Eksplan yang telah ditanam, agar dapat tumbuh menjadi kalus dan kemudian menjadi planlet, membutuhkan pemeliharaan yang
rutin dan tepat. Artinya, eksplan
atau kalus yang sudah waktunya untuk
dipindahkan ke dalam media tanam yang baru harus segera dilaksanakan, tidak
boleh sampai terlambat. Pemindahan yang terlambat dapat menyebabkan pertumbuahn
eksplan atau kalus dapat terhenti atau dapat mengalami brownig atau terkontaminasi
oleh jamur atau bakteri.
B. Pelaksanaan Kultur Jaringan
1. Sterilisasi Alat Penabur
Sebelum digunakan, enkas harus diterilisasi dengan
menggunakan hand sprayer berisi spirtus atau campuran formalin 10% dan alkohol
70%, dengan perbandinga 1:1. setelah disemprot kemudian dibiarkan terlebih
dahulu kurang lebih 10 menit, baru kemudian boleh digunakan.
2. Sterilisasi Alat dan Medium
Alat-alat dissecting –set dan glass ware yang akan
digunakan untuk kultur jaringan, setelah dicuci dan dikeringkan kemudian
dibungkus dengan kertas payung dan disterilisasi di dalam autoklaf dengan suhu
121 oC, tekanan 15 lb, dan lama sterilsiasi 20-30
menit.
Botol-botol eksplan yang sudah berisi medium setelah ditutup dengan
alumunium foil, kemudian disterilisasi. Sterilisasi medium lebih sedikit
waktunya dibandingkan dengan sterilisasi alat-alat, yakni 15 menit, tetapi suhu
dan tekannya sama.
3. Sterilisasi Eksplan
Sterilisasi eksplan dilaksanakan dengan dua cara
yaitu:
a. Sterilisasi Eksplan secara Mekanis
Cara ini digunakan untuk eksplan yang keras atau berdaging, yaitu dengan membakar eksplan
tersebut di atas lampu spirtus sebanyak tiga kali.
b. Sterilisasi Eksplan secara
Kimiawi
Sterilisasi ini gunakan untuk eksplan yang lunak. Sterilisasi ini menggunakan bahan kimia.
Bahan-bahan yang digunakan untuk sterilisasi:
1.
Sodium
hipoklorit
2.
Mercuri
chlorit
3.
Alkohol 70%
4. Menabur Eksplan
Menabur eksplan dilakukan di dalam Laminar Air
Flow Cabinet dengan kondisi aseptik. Sebelum kita bekerja di dalam laminar air
flow cabinet, semua perhiasan tangan harus dilepas, dan tangan dibasuh terlebih
dahulu dengan alkohol 70%. Eksplan
yang siap ditaman dipotng dengan menggunakan scalpel di dlam cawan petri.
Potongan eksplan dimasukan kedalam
erlenmeyer yang berisi media tumbuh, hingga permukaan yang teriris bersentuhan
dengan medium. Setelah semua pekerjaan menabur selesai, kemudian alat-alat yang
sudah dipakai dibersihkan.
5. Melaksanakan Sub-Kultur
Dalam waktu satu sampai dua minggu, eksplan akan tumbuh menjadi kalus. Kalus adalah suatu masa sel yang terbentuk pada permukaan eksplan
atau irisan eksplan. Kalus ini akan tumbuh pada media eksplan yang padat., sedangkan pada
media cair akan tumbuh plb (protokormus).
Sub-kultur adalah suatu usaha untuk mengganti media kultur jaringan dengan
media yang baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk kalus atau protokormus dapat
terpenuhi.
Masalah-masalah Dalam Kultur
Jaringan
Dalam kegiatan kultur jaringan, tidak sedikit
masalah-masalah yang muncul sebagai pengganggu dan bahkan menjadi penyebab
tidak tercapainya tujuan kegiatan kultur yang dilakukan. Gangguan kultur secara
umum dapat muncul dari bahan yang ditanam, dari lingkungan kultur, maupun dari
manusianya.
Permasalahan dalam kultur ada yang dapat
diprediksi sebelumnya dan ada pula yang sulit diprediksi kejadiannya. Untuk
yang tidak dapat diprediksi, car mengatasinya tidak dapat secara preventif
tetapi diselesaikan setelah kasus itu muncul.
Adapun masalah-masalah yang terjadi
dalam kultur jaringan yaitu:
1) Kontaminasi
Kontaminasi
adalah gangguan yang sangat umum
terjadi dalam kegiatan kultur jaringan. Munculnya gangguan ini bila dipahami
secara mendasar adalah merupakan sesuatu yang sangat wajar sebagai konsekuensi
penggunaan yang diperkaya.
Penomena kontaminasi sangat beragam, keragaman
tersebut dapat dilihat dari jenis kontaminasinya (bakteri, jamur, virus, dll).
Upaya mencegah terjadinya kontaminsai.
Biasakan
membersihkan berbagai sarana yang diperlukan dalam kultur jaringan.
Yakinkan
bahwa proses sterilisasi media secara baik dan benar.
Lakukan
proses penanaman bahan pada keadaan anda nyaman dan cari waktu yang longgar.
2) Pencoklatan/browning
Pencoklatan
adalah suatu karakter munculnya
warna coklat atau hitam yang sering membuat tidak terjadinya pertumbuhan dan
perkembangan eksplan. Peristiwa
pencoklatan sesunggguhnya merupakan peristiwa alamiah yang biasa yang sering
terjadi.
Pencoklatan
umumnya merupakan suatu
tanda-tanda kemunduran fisiologi eksplan
dan tidak jarang berakhir pada kematian eksplan.
3) Vitrifikasi
Vitrifikasi
adalah suatu istilah problem pada kultur
yang ditandai dengan:
1.
Munculnya
pertumbuhan dan pertumbuhan yang tidaknormal.
2.
Tanaman yang
dihasikan pendek-pendek atau kerdil.
3.
Pertrumbuhan
batang cenderung ke arah penambahan diameter
4.
Tanaman
utuhnya menjadi sangat turgescent.
5.
Pada daunnya
tidak memiliki jaringan pallisade..
4) Variabilitas Genetik
Bila kultur jaringan digunakan untuk upaya
perbanyakan tanaman yang seragam dalam jumlah yang banyak, dan bukan sebagai
upayapemuliaan tanaman maka variasi
genetik adalah kendala. Variasi
genetik dapat terjadi pada kultur in
vitro karena:
1. Laju multiflikasi
yang tinggi, variasi terjadi karena terjadinya sub kultur berulang yang tidak terkontrol
2. Penggunaan teknik yang tidak sesuai.
Variasi
genetik yang paling umum terjadi
pada kultur kalus dan kultur suspensi sel, hal tersebut
terjadi karena munculnya sifat instabilitas
kromosom mungkin akibat teknis kultur, media atau hormon.
Cara mengatasi problem variasi genetik tentunya tidak sederhana, harus memperhatikan aspek
yang dikulturkan.
5) Pertumbuhan dan Perkembangan
Problem utama berkaitan dengan proses pertumbuhan
adalah bila eksplan yang ditanam
mengalami stagnasi, dari mulai tanam
hingga kurun waktu tertentu tidak mati tetapi tidak tumbuh.
Untuk menghindari hal itu dapat dilakukan dengan preventif menghindari bahan tanam yang
tidak juvenil atau tidak meristematik. Karena awal pertumbuhan eksplan akan dimulai dari sel-sel yang muda yang aktif membelah,
atau dari sel-sel tua yang muda kembali.
Media juag dapat menjadi sebab terjadinya stagnasi pertumbuhan, karena dari
kondisi medialah suatu sel dapat atau
tidak terdorong melakukan proses pembelahan dan pembesaran dirinya.
Pada proses klutur jaringan yang bersifa inderict embriogenesis, tahapan
pembentukan kalus harus dilanjutkan
dengan mendorong induksi embriosomatik
dari sel-sel kalus. Terjadinya embrio somatik dapat secara endogen atau eksogen.
6) Praperlakuan
Masalah pada kegiatan in vitro bukan hanya dari penanaman eksplan saja, pertumbuahn dan perkembangannya dlama botol saja
tetapi juga sangat bisa dipengaruhi oleh persyaratan kegiatan prapelakuan. Pada kasus ini masalah akan
muncul bila kegiatan prapelakuaan tidak
dilakukan.
Prapelakuan
dilakukan umumnya untuk
tujuan-tujuan tertentu, secara umum adalah dalam rangka menghilangkan hambatan.
Hambatan apat berupa hambatan kemikalis,
fisik, biologis. Hambatan berupa bahan kimia penanganannya harus dimulai
dari pengenalan senyawa aktif, potensi gangguan, proses reaksi dan alternatif
pengelolaannya.
7) Lingkungan Mikro
Masalah lingkungan inkubator juga tidak bisa diabaiakan karena ini juga sering menjadi
masalah. Suhu ruangan inkubator sangat
menentukan optimasi pertumbuhan eksplan,
suhu yang terlalu rendah aatau tinggi dapat mempengaruhi pertumbuhan dan
perkembangan pada eksplan.
Kebutuhan antara satu tananaman dengan tanaman
yang lain berbeda, namunddemikian solusinya sulit dilakukan mengingat umumnya
ruangan inkubator suatu ruangan
laboratorium kultur jaringan tidak bisa dibuat variasi antara satu ruangan
dengan bagian ruangan yang lainnya.
Sehingga optimasi pertumbuhan tidak bisa
diharapkan sama antara kultur yang satu dengan kultur yang lain.